SDS-PAGE ist ein Elektrophoreseverfahren, das Proteine nach ihrem Molekulargewicht auftrennt und das Ergebnis in mit bloßem Auge sichtbaren Banden liefert. Der Name leitet sich von den Anfangsbuchstaben des verwendeten Detergens und des Trennmediums ab: Natriumdodecylsulfat und Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Da es der praktischste Weg ist, zu sehen, auf wie viele Gewichtsgruppen sich ein Proteingemisch verteilt, wird es in Laboren breit eingesetzt.
Das Verfahren behält seinen Platz, obwohl es seit Jahrzehnten angewandt wird. Der Aufbau ist relativ einfach, es erfordert kein teures Gerät, und das Ergebnis lässt sich unmittelbar mit bloßem Auge beurteilen. Einen ersten Eindruck vom Reinheitsgrad einer Probe oder davon, ob sie eine unerwartete Komponente enthält, liefert oft dieses Verfahren.
Das Prinzip des Verfahrens
Proteine sind in ihrem natürlichen Zustand unterschiedlich gefaltet und tragen unterschiedliche Nettoladungen. Diese beiden Variablen machen es unmöglich, die Trennung allein über die Größe vorzunehmen. SDS löst dieses Problem in zweierlei Hinsicht: Es entfaltet das Molekül und hebt so die Faltung auf, und es bindet massenproportional an die Kette und verleiht so jedem Protein eine ähnliche negative Ladungsdichte. Die Bewegung im elektrischen Feld hängt dadurch im Wesentlichen von der Größe des Moleküls ab.
Das Trennmedium ist ein poröses Netz aus Polyacrylamid. Kleine Moleküle wandern leicht durch dieses Netz und kommen weit voran, große Moleküle bleiben durch Reibung zurück. Daraus ergibt sich ein annähernd linearer Zusammenhang zwischen Wanderungsstrecke und dem Logarithmus des Molekulargewichts. Der Acrylamidanteil des Gels bestimmt die Porengröße: Gele mit hohem Anteil trennen kleine Proteine besser, Gele mit niedrigem Anteil große.
In der Praxis wird das Gel meist zweischichtig hergestellt. Die obere, weitmaschige Schicht bündelt die aus verschiedenen Taschen kommenden Proteine zu einer feinen Linie; die eigentliche Trennung findet in der unteren, engmaschigen Schicht statt. Dieser Aufbau sorgt für scharfe Banden. Damit sich das Gel während des Laufs nicht erwärmt, werden Stromstärke und Laufzeit gemeinsam eingestellt.
Die Schritte eines Laufs
- Die Probe wird mit Detergens und Probenpuffer gemischt; wird eine reduzierende Komponente zugegeben, werden die Disulfidbrücken gespalten.
- Das Gemisch wird kurz erhitzt, um die Denaturierung abzuschließen.
- In die Taschen des Gels werden die Proben und eine Standardleiter geladen.
- Es wird ein elektrisches Feld angelegt; da die Proteine negativ geladen sind, wandern sie zum Pluspol.
- Es wird gefärbt; üblich sind Proteinfarbstoffe, die das Gel blau färben, für geringe Mengen werden empfindlichere Verfahren eingesetzt.
- Überschüssiger Farbstoff wird entfernt, und das Gel wird abgebildet, um die Bandenmuster auszuwerten.
Die Wahl der Färbung bestimmt die niedrigste sichtbare Menge. Gängige blaue Farbstoffe sind praktisch und günstig, können aber Banden in niedriger Konzentration übersehen; empfindlichere Verfahren machen geringe Mengen von Komponenten sichtbar, sind dafür aber aufwendig in der Durchführung. Dass eine Bande nicht zu sehen ist, bedeutet deshalb nicht, dass bei diesem Gewicht keine Komponente vorhanden ist.
Leiter und Ablesen des Gewichts
Die Standardleiter ist ein Gemisch aus Proteinen bekannten Molekulargewichts und bildet auf dem Gel einen Referenzmaßstab. Die Lage der Probenbanden wird mit diesem Maßstab verglichen, und so wird das ungefähre Gewicht bestimmt. In der Referenzchargenanalyse wurde eine Leiter verwendet, die den Bereich von 10 bis 250 Kilodalton abdeckt; die Hauptproteindichte der Probe wurde im Bereich von 10–25 Kilodalton beobachtet, und bei etwa 37 Kilodalton wurde eine deutliche Bande verzeichnet.
| Beobachtung | Mögliche Bedeutung |
|---|---|
| Scharfe, einzelne Bande | Eine dominante Komponente oder eine schmale Gewichtsgruppe |
| Viele feine Banden | Das Gemisch verteilt sich über einen breiten Gewichtsbereich |
| Verwaschene Bande | Überladung oder Problem bei den Laufbedingungen |
| Ansammlung am Taschenboden | Ungelöstes oder verklumptes Material |
| Fehlende Bande | Zu geringe Beladung oder Unterschreiten der Färbeempfindlichkeit |
Auch die Beladungsmenge beeinflusst das Ergebnis. In der Referenzchargenanalyse wurde die Probe als Reihe mit 5 bis 30 Mikrogramm aufgetragen; so lässt sich der Bereich beobachten, in dem schwache Banden sichtbar sind und dichte Banden nicht überlaufen.
Was bei Giftproben zu beachten ist
Die interessanten Peptide des Gifts sind sehr klein und liegen in Standardgelen nahe der unteren Grenze; deshalb werden Gele mit hohem Acrylamidanteil oder für kleine Moleküle geeignete Puffersysteme bevorzugt. Der zweite Punkt ist der Reduktionsschritt: Da sich das Wanderungsverhalten des Peptids ändern kann, wenn die Disulfidbrücken gespalten werden, werden Bedingungen mit und ohne Reduktionsmittel getrennt beurteilt. Die Rolle der Brücken in der Struktur wird im Beitrag zu Disulfidbrücken erläutert. Damit die Beladungsmenge richtig gewählt werden kann, muss die Gesamtproteinlast der Probe vorab gemessen werden; diese Messung wird im Beitrag zur Proteinbestimmung mit Standardkurve behandelt.
Bei der Berichterstattung werden neben dem Gelbild auch die Laufbedingungen angegeben: Acrylamidanteil des Gels, verwendete Leiter, Reduktionszustand und Beladungsmenge. Ohne diese Angaben lässt sich ein Bandenmuster nicht mit dem Ergebnis einer anderen Untersuchung vergleichen. Auch das Aufbewahren des Bildes in skalierter und unbearbeiteter Form ist für spätere Auswertungen erforderlich.
Was sagt das Verfahren nicht aus?
Der Wert, den die Elektrophorese liefert, ist das scheinbare Molekulargewicht, nicht die exakte Masse. Ladungsverteilung, Faltungsreste oder an das Molekül gebundene Zuckergruppen können die Wanderung beeinflussen und eine Lage ergeben, die von der erwarteten abweicht. Auch innerhalb einer Bande können mehrere Komponenten vorhanden sein. Für die exakte Masse und Sequenzinformation wird auf Verfahren wie die Massenspektrometrie übergegangen. Die Elektrophorese wird deshalb nicht als allein entscheidender Test eingesetzt, sondern als Ebene, die zusammen mit Chromatographie und Spektroskopie gelesen wird. Stellen, an denen sich die drei Verfahren gegenseitig bestätigen, bilden die Grundlage der Beurteilung einer Charge; Stellen, an denen sie auseinandergehen, sind Anlass für eine Wiederholungsmessung. Chargenbezogene Ergebnisse werden auf der Analyseseite veröffentlicht.
