Die meisten kleinen Peptide im Skorpiongift sind gemessen an ihrer Größe erstaunlich widerstandsfähig. Die Hauptquelle dieser Beständigkeit gegenüber Hitze, pH-Änderungen und abbauenden Enzymen sind Disulfidbrücken, die verschiedene Stellen der Kette miteinander verbinden. Dieser Beitrag behandelt die Chemie der Brücke, ihre Rolle in der Peptidstruktur und wie sie im Labor untersucht wird.
Was ist eine Disulfidbrücke?
Cystein, eine der zwanzig Standardaminosäuren, trägt an seiner Seitenkette eine Thiolgruppe, also ein Ende aus Schwefel und Wasserstoff. Kommen sich zwei Cysteinreste im Raum nahe genug, werden die Wasserstoffe der Thiolgruppen durch eine Oxidationsreaktion abgespalten, und zwischen den beiden Schwefelatomen entsteht eine kovalente Bindung. Die entstehende Schwefel-Schwefel-Bindung heißt Disulfidbrücke, das durch diese Bindung verknüpfte Cysteinpaar heißt Cystin.
Die Brücke kann zwei in der Kette weit voneinander entfernte Punkte verbinden. Eine lineare Aminosäuresequenz wird durch diese Verknüpfungen in eine bestimmte dreidimensionale Gestalt eingerastet. Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen unterstützen die Faltung ebenfalls, sind aber schwache und leicht umkehrbare Wechselwirkungen; die Disulfidbrücke ist dagegen kovalent und deshalb viel stabiler.
In der Zelle werden Brücken nicht zufällig gebildet. Proteine, die sezerniert werden, falten sich in einem besonderen Kompartiment der Zelle in oxidierendem Milieu, und dabei lösen Hilfsenzyme falsch gebildete Bindungen auf und paaren sie neu. Auch die Zellen der Giftdrüse bereiten ihre Peptide auf diesem Weg vor und geben sie gefaltet ins Sekret ab.
Disulfidbrücken sind nicht auf Gifte beschränkt. Hormone wie Insulin, Antikörper und viele Abwehrpeptide fixieren ihre Struktur ebenfalls durch diese Bindungen; auch die Peptide in den Giften von Spinnen und Kegelschnecken sind reich an Cystein. Eine hohe Brückenzahl ist ein gemeinsames Merkmal von Molekülen, die meist nach außerhalb der Zelle abgegeben werden und in schwierigem Milieu funktionieren müssen.
Brückenmuster in Skorpiontoxinen
Ein erheblicher Teil der Skorpiontoxine teilt ein gemeinsames Gerüst, die sogenannte cysteinstabilisierte Alpha-Beta-Faltung. In dieser Struktur ist ein kurzer helikaler Bereich durch Disulfidbrücken mit einem zwei- oder dreisträngigen Beta-Faltblatt verbunden. Zwischen den beiden Cysteinen auf der Helix liegen drei Reste, zwischen den beiden Cysteinen auf dem Beta-Strang ein einzelner Rest; dieses Muster ist eine der Sequenzsignaturen, an denen die Familie erkannt wird.
| Peptidgruppe | Typische Länge | Typische Zahl der Brücken |
|---|---|---|
| Kaliumkanal-Toxine (α-KTx) | Etwa 23–43 Aminosäuren | 3, bei manchen Mitgliedern 4 |
| Natriumkanal-Toxine | Etwa 60–76 Aminosäuren | 4 |
| Chlorotoxin | 36 Aminosäuren | 4 |
Struktur und Ziele der langkettigen Gruppe wurden im Beitrag Natriumkanal-Toxine behandelt.
Eine Lesart anhand des Peptids der Referenzcharge
Die 36 Aminosäuren lange Sequenz des im Bericht zur Referenzcharge identifizierten Peptids α-KTx 3.6 lautet FTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS. Die Sequenz enthält sechs Cysteine, die, vom Anfang aus gezählt, an den Positionen 6, 12, 16, 27, 32 und 34 liegen. Zwischen den Cysteinen an den Positionen 12 und 16 liegen drei Reste, zwischen denen an den Positionen 32 und 34 ein einzelner Rest; die oben beschriebene Signatur ist also auch in dieser Sequenz zu sehen.
Bei diesen Peptiden mit sechs Cysteinen ist das in der Literatur am häufigsten berichtete Paarungsmuster, dass das erste Cystein mit dem vierten, das zweite mit dem fünften und das dritte mit dem sechsten verbunden ist. Die Zahl der Cysteine in einer Sequenz zu zählen, beweist jedoch nicht, welches Cystein mit welchem gepaart ist; die tatsächliche Paarung wird erst mit den unten beschriebenen experimentellen Methoden gezeigt. Im Bericht zur Referenzcharge ist kein Messergebnis zur Brückenpaarung angegeben; deshalb wird hier kein vermutetes Muster angeführt. Der Umfang des Berichts steht auf der Analyseseite.
Wie sorgen die Brücken für Widerstandsfähigkeit?
Eine ungefaltete Peptidkette kann unzählige Gestalten annehmen; der gefaltete Zustand ist nur eine dieser Möglichkeiten. Disulfidbrücken begrenzen von vornherein die Zahl der Gestalten, in die sich die Kette frei entfalten kann. Dadurch wird es energetisch schwieriger, sich von der gefalteten Struktur zu entfernen, und das Molekül behält seine Gestalt länger, wenn die Temperatur steigt oder sich die Umgebungsbedingungen ändern.
Auch die Widerstandsfähigkeit gegenüber Enzymen beruht auf derselben Kompaktheit. Proteasen benötigen einen flexiblen, freiliegenden Abschnitt der Kette, um an die Bindung zu gelangen, die sie spalten sollen; in einem durch Brücken fest gepackten kleinen Peptid gibt es solche Bereiche nur wenige. Diese Eigenschaft erleichtert es, Peptide als verwendbare Werkzeuge in der Forschung einzusetzen, und verleiht ihnen eine vergleichsweise Beständigkeit bei Lagerung in trockener Form oder in Lösung.
Die Schwachstelle der Brücken
Brücken sind stabil, aber nicht unzerbrechlich. Reduzierende Substanzen öffnen die Schwefel-Schwefel-Bindung und führen die Cysteine wieder in den Zustand freier Thiole zurück. Im Labor werden dafür Verbindungen wie Dithiothreitol, Beta-Mercaptoethanol oder TCEP verwendet. In der Proteinanalyse ist das ein bewusster Schritt: Die Reduktion vor der SDS-PAGE öffnet die Brücken und verändert das Verhalten des Moleküls im Gel.
Das zweite Risiko ist der Austausch von Brücken. Sind im Milieu freie Thiolgruppen vorhanden und steigt der pH, können bestehende Brücken mit freien Thiolen ausgetauscht werden, und es können falsch gepaarte Strukturen entstehen; unter sauren Bedingungen verlangsamt sich dieser Austausch. Freie Cysteine während der Analyse chemisch zu blockieren, also zu alkylieren, ist eine übliche Methode, um dieses Durcheinander zu verhindern.
Wie werden Brücken untersucht?
- Massenmessung: Bei der Bildung jeder Brücke werden zwei Wasserstoffatome abgespalten; deshalb ist ein gefaltetes Peptid pro Brücke etwa 2 Dalton leichter als sein reduzierter Zustand. Für ein Peptid mit drei Brücken beträgt der Unterschied etwa 6 Dalton.
- Reduktionsvergleich: Der reduzierte und der nicht reduzierte Zustand derselben Probe werden in der Chromatographie oder Elektrophorese nebeneinander untersucht.
- Spaltung ohne Reduktion: Das Peptid wird unter Erhalt der Brücken enzymatisch gespalten; Fragmente, die durch eine Brücke verbunden bleiben, zeigen, welche Cysteine gepaart sind.
- Strukturaufklärung: Kernspinresonanz und Kristallographie zeigen die dreidimensionale Lage der Brücken direkt.
Die genaue Messung von Massenunterschieden erfolgt mit der im Beitrag zur Massenspektrometrie beschriebenen Methode.
Reicht die aus natürlicher Quelle gewonnene Menge nicht aus, greift man auf chemische Synthese oder rekombinante Herstellung zurück. Die auf diesen Wegen gewonnene lineare Kette wird in Puffern mit reduziertem und oxidiertem Glutathion kontrolliert gefaltet. Im entstehenden Gemisch können Isomere mit unterschiedlicher Paarung vorliegen; das richtige Isomer wird chromatographisch abgetrennt und dadurch bestätigt, dass es bei gemeinsamer Messung mit dem natürlichen Peptid an derselben Stelle eluiert. Die Peptidfamilie der Kaliumkanäle und ihre Benennungsordnung wurden im Beitrag zu α-KTx vorgestellt.
