Patch-Clamp ist ein elektrophysiologisches Verfahren, mit dem sich sehr kleine elektrische Ströme messen lassen, die durch Ionenkanäle in der Membran einer einzelnen Zelle fließen. Erwin Neher und Bert Sakmann, die das Verfahren entwickelten, erhielten 1991 für ihre Entdeckungen zur Funktion einzelner Ionenkanäle den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Heute ist es eines der grundlegenden Messwerkzeuge bei der Erforschung von Molekülen, die Ionenkanäle beeinflussen, einschließlich Giftpeptiden.
Ein bedeutender Teil der Peptide im Skorpiongift bindet an Kalium-, Natrium- oder Chloridkanäle. Welchen Kanal ein Peptid wie stark und wie selektiv beeinflusst, wird weitgehend durch Patch-Clamp-Messungen bestimmt. Dieser Beitrag beschreibt das Grundprinzip des Verfahrens, die verwendeten Aufzeichnungsmodi und wie eine Messung gelesen wird, in groben Zügen.
Das Grundprinzip des Verfahrens
Eine Glasmikropipette mit einer Spitze im Mikrometerbereich wird mit einer leitfähigen Lösung gefüllt und an die Zellmembran angelegt. Bei leichtem Sog entsteht zwischen Glas und Membran ein sehr dichter Kontakt. Der Widerstand dieses Kontakts liegt im Gigaohm-Bereich, also bei Milliarden Ohm, weshalb er „Gigaseal“ genannt wird. Bei so guter Isolation lassen sich Ströme im Pikoampere-Bereich, die durch das kleine Membranstück an der Pipettenspitze fließen, vom Rauschen unterscheiden.
Die Messung erfolgt meist im Spannungsklemm-Modus (Voltage Clamp): Der Verstärker hält die Membranspannung auf einem vom Forschenden festgelegten Wert konstant und zeichnet den dafür erforderlichen Strom auf. Dieser aufgezeichnete Strom ist der Strom, der in diesem Moment durch die geöffneten Ionenkanäle fließt. Im Stromklemm-Modus (Current Clamp) wird dagegen der Strom konstant gehalten und die Änderung der Membranspannung aufgezeichnet; dieser Modus wird überwiegend zur Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Nervenzellen verwendet.
Bei der Messung werden die Zusammensetzung der Lösungen innerhalb und außerhalb der Zelle, die Temperatur und die angelegten Spannungsstufen aufgezeichnet. Die Ergebnisse verschiedener Labore sind nur dann miteinander vergleichbar, wenn diese Bedingungen bekannt sind.
Die vier grundlegenden Aufzeichnungsmodi
| Modus | Wie wird er aufgebaut? | Was wird gemessen? |
|---|---|---|
| Zellgebunden (Cell-attached) | Die Pipette haftet an der Membran, die Membran bleibt intakt | Einzelkanalströme einiger Kanäle unter der Pipette |
| Ganzzell (Whole-cell) | Die Membran unter der Pipette wird durchbrochen, die Pipette öffnet sich in das Zellinnere | Gesamtstrom aller Kanäle der Zelle |
| Innen-außen (Inside-out) | Ein Membranstück wird abgerissen, seine Innenseite zeigt zur Lösung | Wirkung von Substanzen, die auf der zytoplasmatischen Seite appliziert werden |
| Außen-außen (Outside-out) | Durch Zurückziehen aus dem Ganzzell-Modus wird ein kleines Membranstück gewonnen | Wirkung von Substanzen, die auf die Außenseite appliziert werden, zum Beispiel von Toxinen |
Da Giftpeptide meist von der Außenseite der Zelle an Kanäle binden, wird in Screening-Untersuchungen am häufigsten der Ganzzell-Modus verwendet: Das Peptid wird der die Zelle umgebenden Lösung zugesetzt, und die Änderung des Stroms wird beobachtet.
Wie werden Giftpeptide getestet?
Der zu untersuchende Kanal wird meist in einer Zelllinie hergestellt, in die sein eigenes Gen eingebracht wurde; so stammt der größte Teil des gemessenen Stroms von einer einzigen Kanalart. Anschließend werden folgende Schritte durchlaufen:
- Vor der Zugabe des Peptids wird ein stabiler Basiswert des Kanalstroms aufgezeichnet.
- Das Peptid wird in steigenden Konzentrationen appliziert, und bei jeder Konzentration wird gemessen, wie stark der Strom abnimmt oder sich verändert.
- Das Peptid wird aus dem Medium ausgewaschen, um zu sehen, ob die Wirkung zurückgeht.
- Aus der Konzentrations-Wirkungs-Kurve wird die Konzentration berechnet, die den Strom halbiert (IC50).
- Dieselben Messungen werden an anderen Kanalsubtypen wiederholt, um die Selektivität zu bestimmen.
Die Selektivität wird als Verhältnis der IC50-Werte desselben Peptids an verschiedenen Kanälen ausgedrückt; je größer das Verhältnis, desto stärker unterscheidet das Peptid den Zielkanal von den anderen.
Untersuchungen an Kv1-Kanälen sind ein typisches Beispiel für diesen Ansatz: Durch Vergleich der IC50-Werte eines α-KTx-Peptids an Kv1.1, Kv1.2 und Kv1.3 lässt sich erkennen, für welchen Kanal es selektiver ist. Bei Toxinen von Natriumkanälen wird dagegen weniger die Abnahme des Stroms als die Veränderung im Öffnungs- und Schließverhalten des Kanals beobachtet; die Eigenschaften dieser Familie werden im Beitrag zu Natriumkanal-Toxinen beschrieben.
Automatisierte Patch-Clamp und Grenzen
Klassische Patch-Clamp erfordert, dass eine erfahrene Forscherin oder ein erfahrener Forscher unter dem Mikroskop Zelle für Zelle arbeitet, und pro Tag lässt sich nur eine begrenzte Zahl von Aufzeichnungen gewinnen. Automatisierte Patch-Clamp-Systeme messen mit planaren Chips mit kleinen Löchern statt Pipetten viele Zellen gleichzeitig; das Screening vieler Moleküle wird dadurch beschleunigt.
Bei der Interpretation der Ergebnisse sind einige Grenzen zu beachten: Ein in einer Zelllinie hergestellter Kanal kann sich anders verhalten als der natürliche Kanal im Gewebe; Reinheit und Konzentration des Peptids müssen genau bekannt sein, da sie den IC50-Wert unmittelbar beeinflussen. Messungen mit aufgetrennten und in ihrer Identität bestätigten Peptiden liefern deshalb verlässlichere Ergebnisse als Messungen mit Rohgift. Das analytische Profil von Rohgift finden Sie auf unserer Seite zu den Analyseergebnissen.
