Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, kurz HPLC, ist eine analytische Methode, mit der die Komponenten eines Gemischs voneinander getrennt und jede abgetrennte Komponente einzeln sichtbar gemacht wird. Bei Proben, die wie Gift Dutzende von Komponenten enthalten, ist dies der gebräuchlichste Weg, ein Profil zu erstellen.
Die Methode verdankt die Bezeichnung Hochleistung dem feinkörnigen Füllmaterial. Je kleiner die Partikel, desto schärfer die Trennung, aber desto größer auch der Strömungswiderstand; um diesen Widerstand zu überwinden, werden Pumpen benötigt, die unter hohem Druck arbeiten. In modernen Systemen werden Pumpe, Injektionseinheit, Säulenofen und Detektor in einer einzigen Fließstrecke gemeinsam gesteuert, und alle Bedingungen werden von der Software aufgezeichnet.
Funktionsprinzip
Das Herzstück des Systems ist eine Säule, die dicht mit Füllmaterial gepackt ist. Die Pumpe fördert das Lösungsmittel, die sogenannte mobile Phase, unter hohem Druck durch diese Säule. Wird die Probe in den Strom injiziert, wechselwirkt jede Komponente unterschiedlich stark mit dem Füllmaterial (stationäre Phase) und dem Lösungsmittel. Eine Komponente, die stärker an der stationären Phase haftet, bleibt länger in der Säule, eine schwächer haftende tritt früher aus. Der Detektor am Säulenausgang misst den durchlaufenden Stoff und zeichnet ein Signal gegen die Zeit; diese Grafik heißt Chromatogramm.
Eine konstante Säulentemperatur ist für die Reproduzierbarkeit wichtig; ändert sich die Temperatur, ändert sich auch das Haftungsverhalten der Komponenten, und die Peaks verschieben sich. Aus demselben Grund wartet man vor jeder Messung, bis die Säule unter Anfangsbedingungen equilibriert ist. Dass in Berichten Gerätemodell, Säulentyp und Programmbedingungen angegeben werden, dient dazu, dass das Ergebnis in einem anderen Labor wiederholt werden kann. Bei der Analyse der Referenzcharge erfolgte die Trennung mit einem System Shimadzu Prominence-i LC2030 3D.
Was bedeutet Umkehrphase?
In der klassischen Normalphasenchromatographie ist die stationäre Phase polar und die mobile Phase unpolar. In der Umkehrphase (RP-HPLC) wird dieses Verhältnis umgekehrt: Die stationäre Phase wird durch an die Silikaoberfläche gebundene lange Kohlenwasserstoffketten unpolar gemacht, die mobile Phase ist wässrig und polar. Die Trennung erfolgt so nach der Hydrophobizität der Moleküle. Da Peptide sowohl wasserliebende als auch wasserabweisende Oberflächen tragen, ist dieser Ansatz in der Peptidanalyse zum Standard geworden.
In der Praxis wird die mobile Phase nicht in einer einzigen Zusammensetzung belassen. Anfangs besteht sie überwiegend aus Wasser; im Lauf der Zeit wird der Anteil des organischen Lösungsmittels schrittweise erhöht. Bei dieser Gradientenelution genannten Methode treten hydrophile Komponenten früh und hydrophobe spät aus, und ein weiter Polaritätsbereich wird in einer einzigen Messung abgedeckt. Bei der Analyse der Referenzcharge wurde mit einer Umkehrphasensäule ein flacher Gradient angewendet, und der Anteil des organischen Lösungsmittels wurde von null auf sechzig Prozent erhöht.
Warum wird bei 280 nm detektiert?
Proteine und Peptide absorbieren aufgrund der Tryptophan- und Tyrosinreste in ihrer Struktur Licht um 280 Nanometer. Bei dieser Wellenlänge zu messen, begrenzt das Rauschen durch Pufferbestandteile und macht proteinhaltige Peaks selektiv sichtbar. Die Physik der Absorption wird im Beitrag Messung bei 280 nm behandelt.
Die Schritte einer Messung
- Die Probe wird eingewogen und in einem geeigneten Lösungsmittel in bestimmter Konzentration angesetzt; bei der Analyse der Referenzcharge wurde die Probe mit 1000 ppm gelöst.
- Die Lösung wird filtriert, um Partikel zu entfernen; dieser Schritt wird nicht übersprungen, damit die Säule nicht verstopft.
- Die Säule wird unter Anfangsbedingungen equilibriert.
- Die Probe wird injiziert und das Gradientenprogramm gestartet.
- Das Detektorsignal wird aufgezeichnet, die Peaks werden anhand von Retentionszeit und Fläche ausgewertet.
- Bei Bedarf werden die Peaks einzeln gesammelt und für weitere Analysen weitergegeben.
Die Probenvorbereitung ist die Quelle der meisten Probleme. Nicht gelöste Partikel verstopfen den Säuleneingang, ein ungeeignetes Lösungsmittel verzerrt die Peakform. Deshalb wird die Probe in einem Lösungsmittel angesetzt, das der Anfangszusammensetzung der mobilen Phase nahekommt, und vor der Injektion filtriert. Auch ein im Verhältnis zur Säule angemessenes Injektionsvolumen verhindert eine Verbreiterung der Peaks.
Was sagt das Chromatogramm aus?
| Kriterium | Bedeutung |
|---|---|
| Retentionszeit | Der Moment, in dem die Komponente die Säule verlässt; unter gleichen Bedingungen eine reproduzierbare Kennung |
| Peakfläche | Steht in Beziehung zur relativen Menge der Komponente |
| Peakzahl | Zeigt die Zahl der auflösbaren Komponenten |
| Peakbreite | Gibt Auskunft über die Trennleistung und den Zustand der Säule |
| Basislinie | Ihre Drift weist auf system- oder gradientenbedingte Probleme hin |
Bei der Analyse der Referenzcharge wurden bei 280 nm 37 Proteine und Peptide aufgelöst. Man sollte nicht vergessen, dass diese Zahl von den Bedingungen abhängt: Ändern sich Säulentyp, Gradientensteigung und Detektionswellenlänge, kann aus derselben Probe eine andere Zahl von Peaks erhalten werden. Einzelheiten zum Lesen eines Chromatogramms behandelt der Beitrag zum Chromatogramm.
Peakflächen werden meist relativ bewertet. Um die Menge einer Komponente absolut anzugeben, muss mit Lösungen derselben Komponente in bekannten Konzentrationen kalibriert werden. Da für die meisten Giftkomponenten kein reiner Standard vorliegt, wird das Profil weniger als quantitative Messung, sondern eher als vergleichender Fingerabdruck verwendet.
Die abgetrennten Peaks können nicht nur beobachtet, sondern auch gesammelt werden. Wird der Strom am Säulenausgang zeitabhängig in getrennte Gefäße geleitet, erhält man jeden Peak als eigene Fraktion. Diese Fraktionen können gefriergetrocknet und gelagert werden und in späteren Analysen wie eine einzelne Komponente untersucht werden. Die Isolierung eines interessanten Peptids aus einem komplexen Gemisch beginnt meist auf diesem Weg. Wird nicht aufgezeichnet, aus welcher Messung und welchem Zeitfenster die gesammelte Fraktion stammt, geht auch die Identität der Fraktion verloren; deshalb wird der Sammelplan vor der Analyse schriftlich festgelegt.
Grenze der Methode
HPLC trennt Komponenten, sagt aber allein nichts über ihre Identität. Um zu bestimmen, welchem Peptid ein Peak entspricht, werden Molekülmasse und Sequenzinformation benötigt; deshalb wird die Chromatographie meist zusammen mit Methoden wie SDS-PAGE und Massenspektrometrie eingesetzt. Unseren gesamten Analyseablauf finden Sie zusammengefasst auf der Analyseseite.
