Es gibt kein Gerät, das direkt abliest, wie viel Protein in einer Lösung enthalten ist. Gemessen wird immer eine indirekte Größe: meist die Menge des bei einer bestimmten Wellenlänge absorbierten Lichts. Um diese Ablesung in eine Konzentration in Milligramm umzurechnen, ist eine Umrechnungsregel nötig, und diese Regel ist die Standardkurve.
Die Standardkurve ist eine Bezugslinie, die durch das Ablesen von Lösungen bekannter Konzentrationen entsteht. Die Ablesung der unbekannten Probe findet auf dieser Linie ihre Entsprechung. Das Verfahren wirkt einfach, die Verlässlichkeit des Ergebnisses hängt jedoch vollständig davon ab, wie die Kurve aufgebaut wurde.
Bei der Proteinbestimmung werden mehrere Ansätze verwendet. Einer nutzt einen Farbstoff, der beim Binden an Protein die Farbe wechselt; ein anderer beruht auf der Reduktion von Kupferionen in Gegenwart von Protein; der direkteste Weg besteht darin, die Absorption der Lösung im ultravioletten Bereich abzulesen. Welcher Weg auch gewählt wird, es braucht eine Kalibrierung, die die Ablesung in eine Konzentration übersetzt.
Wie wird die Standardreihe hergestellt?
Zunächst wird eine Lösung eines Referenzproteins bekannter Konzentration hergestellt. Aus dieser Lösung werden durch Reihenverdünnungen einige Zwischenkonzentrationen gewonnen, die den zu messenden Bereich abdecken. Die Reihe wird so ausgelegt, dass sie den erwarteten Probenwert sowohl unter- als auch überschreitet; fällt die Probe außerhalb der Kurve, beruht das Ergebnis auf einer Schätzung.
Standards und Probe werden im selben Lösungsmittel, unter denselben Bedingungen und in derselben Sitzung abgelesen. Mit einer an verschiedenen Tagen hergestellten Kurve zu arbeiten, überträgt geräte- und umgebungsbedingte Abweichungen auf das Ergebnis. Jede Konzentration mehrfach abzulesen und den Mittelwert zu verwenden, ist ebenfalls gängige Praxis.
Auch wird festgehalten, welches Protein als Standard verwendet wurde. Üblich ist ein gereinigtes Referenzprotein mit gut definierter Konzentration. Es ist bekannt, dass sich das Referenzprotein nicht genau wie die Proteine der Probe verhält; das Ergebnis wird deshalb als Äquivalentwert gelesen, der auf das gewählte Referenzprotein bezogen ist.
Von der Kurve zur Gleichung
Die Ablesungen werden mit der Konzentration auf der horizontalen und der Absorption auf der vertikalen Achse eingetragen. Die am besten passende Gerade durch die Punkte wird mit linearer Regression berechnet. Das Ergebnis ist eine Gleichung der folgenden Form:
y = Steigung × x + Achsenabschnitt
Dabei ist y die abgelesene Absorption und x die gesuchte Konzentration. Die Ablesung der Probe wird in die Gleichung eingesetzt und nach x aufgelöst, um die Konzentration zu erhalten; danach wird gegebenenfalls mit dem Verdünnungsverhältnis multipliziert. Dass der Achsenabschnitt von null verschieden ist, ist normal und rührt meist daher, dass die Blindwertablesung nicht genau null ergibt.
Auch die Wiederholung der Messung gehört zur Verlässlichkeit. Mehrere Ablesungen für jeden Standard und jede Probe zu nehmen, verhindert, dass ein einzelner Pipettierfehler das Ergebnis verschiebt. Ist der Unterschied zwischen den Ablesungen größer als erwartet, werden die Vorbereitungsschritte überprüft, bevor die Kurve akzeptiert wird.
Was sagt der R²-Wert aus?
Das Bestimmtheitsmaß zeigt, wie gut die Punkte auf die berechnete Gerade passen. Je näher es bei eins liegt, desto besser ist die Übereinstimmung. In der Laborpraxis weist ein hoher Wert darauf hin, dass die Standardreihe sauber hergestellt und die Messung im linearen Bereich durchgeführt wurde.
Dennoch ist es allein kein ausreichendes Kriterium. Ein hohes Bestimmtheitsmaß schließt nicht aus, dass die Standards in falscher Konzentration hergestellt wurden; es besagt nur, dass die Punkte untereinander konsistent sind. Die Beurteilung erfolgt deshalb auch anhand der Grafik der Kurve: Krümmen sich die Punkte an den Enden, zeigt das, dass der lineare Bereich überschritten wurde.
| Element | Entsprechung im Bericht der Referenzcharge |
|---|---|
| Gleichung der Standardkurve | y = 0,0011x + 0,1726 |
| Bestimmtheitsmaß | R² = 0,9903 |
| Ermittelte Proteinkonzentration | 28 mg/mL |
| Ort der Messung | Unabhängiges Labor außerhalb der Anlage |
Die Werte in der Tabelle gehören zu einer einzigen Charge. Die Messung wird für jede Charge neu durchgeführt, und das Ergebnis kann sich von Charge zu Charge unterscheiden; der Bericht wird deshalb nicht als unveränderliche Eigenschaft des Produkts, sondern als Steckbrief einer bestimmten Probe gelesen.
Auch die Erneuerung der Kurve in bestimmten Abständen gehört zur guten Praxis. Mit einer vor langer Zeit aufgebauten Kurve zu arbeiten, bedeutet anzunehmen, dass sich Gerät und Lösungen seither nicht verändert haben. Lagerbedingungen und Verfallsangaben der Standardlösungen werden deshalb ebenfalls dokumentiert.
Häufige Fallstricke
- Ablesung außerhalb des Bereichs: Überschreitet die Absorption der Probe die Obergrenze der Kurve, wird das Ergebnis unzuverlässig; die Probe wird verdünnt und die Messung wiederholt.
- Wahl des Blindwerts: Die Blindmessung muss mit demselben Lösungsmittel wie die Probe erfolgen; ein anderes Lösungsmittel verschiebt den Achsenabschnitt.
- Störende Substanzen: Pufferbestandteile, Detergenzien und Reduktionsmittel können die Ablesung je nach Verfahren beeinflussen.
- Unterschied im Referenzprotein: Das Ergebnis wird auf das Protein bezogen, mit dem die Kurve aufgebaut wurde; ein anderes Referenzprotein kann einen anderen Wert ergeben.
- Verdünnungsfehler: Bei Verdünnungen kleiner Volumina wirkt sich der Pipettierfehler unmittelbar auf das Ergebnis aus.
Auch wie das Ergebnis berichtet wird, ist wichtig. Die Konzentration wird meist in Milligramm pro Milliliter angegeben; ist die Gesamtproteinmenge gefragt, wird dieser Wert mit dem Volumen multipliziert. Der Bericht enthält neben der Zahl auch das Verfahren, das verwendete Referenzprotein und die Messbedingungen. Ohne diese Angaben sind die Ergebnisse zweier Labore nicht direkt vergleichbar.
Wo wird das Ergebnis verwendet?
Die Proteinkonzentration ist über die Zahl an sich hinaus Eingangsgröße für nachfolgende Analysen. Wie viel Probe in der Elektrophorese auf das Gel geladen wird, richtet sich nach diesem Wert; Einzelheiten des Verfahrens werden im SDS-PAGE-Beitrag beschrieben. Die physikalische Grundlage der Absorptionsmessung wird im UV-Vis-Beitrag behandelt.
Der Wert ist auch Teil des Chargensteckbriefs und wird im Analysezertifikat zusammen mit dem Verfahren angegeben; wie das Zertifikat zu lesen ist, wird im CoA-Beitrag beschrieben. Dass die Messung außerhalb der Anlage in einem unabhängigen Labor erfolgt, hat bei der Bewertung des Ergebnisses zusätzliches Gewicht. Unsere chargenbezogenen Ergebnisse werden auf der Analyseseite veröffentlicht.
