Die Chromatographie trennt ein Gift in seine Komponenten, sagt aber nicht, was die aufgetrennten Peaks sind. Um die Identität einer Komponente zu bestimmen, müssen ihre Masse und möglichst ihre Aminosäuresequenz bekannt sein. Die Massenspektrometrie ist das Verfahren, das beide Informationen gemeinsam liefern kann, und eines der wichtigsten Werkzeuge der Peptididentifizierung in der Giftforschung.
Das Prinzip des Verfahrens
Ein Massenspektrometer wiegt Moleküle nicht direkt. Es wandelt sie zunächst in elektrisch geladene Teilchen, also Ionen, um und trennt diese Ionen dann nach ihrem Verhalten in elektrischen oder magnetischen Feldern. Die gemessene Größe ist nicht die Masse selbst, sondern das Verhältnis von Masse zu Ladung, angegeben als m/z. Das Ergebnis ist ein Spektrum mit m/z auf der horizontalen und der Signalintensität auf der vertikalen Achse.
| Komponente | Aufgabe | Gängige Beispiele |
|---|---|---|
| Ionenquelle | Lädt das Molekül auf, ohne es zu zerstören | Elektrospray, matrixunterstützte Laserionisation |
| Massenanalysator | Trennt die Ionen nach ihrem m/z-Wert | Flugzeit, Quadrupol, Ionenfalle |
| Detektor | Zählt die aufgetrennten Ionen | Elektronenvervielfacher und ähnliche Systeme |
Für große und empfindliche Moleküle wie Peptide wurden schonende Ionisierungsverfahren entwickelt. Bei der Elektrospray-Methode wird die Lösung unter Hochspannung aus einer feinen Nadel versprüht; beim Verdampfen der Tröpfchen gehen die Moleküle geladen in die Gasphase über. Da sich dieses Verfahren direkt an die Flüssigchromatographie koppeln lässt, können Trennung und Messung in einem einzigen Ablauf erfolgen. Bei der matrixunterstützten Laser-Methode wird die Probe dagegen zusammen mit einer lichtabsorbierenden Hilfssubstanz getrocknet und mit kurzen Laserpulsen ionisiert.
Ladungszustände und Masseninformation
Ein per Elektrospray ionisiertes Peptid trägt meist mehr als ein Proton. Dasselbe Molekül erscheint im Spektrum deshalb nicht als einzelne Linie, sondern als Peakserie, die unterschiedlichen Ladungszahlen entspricht. Die Software berechnet aus dieser Serie die ungeladene Masse des Moleküls zurück; diesen Vorgang nennt man Dekonvolution.
Bei hochauflösenden Geräten lässt sich auch die Feinstruktur erkennen, die von den natürlichen stabilen Isotopen des Moleküls stammt. Dieses Detail ist in zweierlei Hinsicht nützlich: Der Abstand zwischen benachbarten Peaks zeigt unmittelbar die Ladungszahl an, und die Form des Isotopenmusters gibt einen Hinweis darauf, ob das gemessene Signal tatsächlich zu einem Peptid gehört.
Die Genauigkeit der Messung hängt von der regelmäßigen Kalibrierung des Geräts ab. Die Kalibrierung erfolgt mit Standardgemischen bekannter Masse; in manchen Untersuchungen wird eine mit der Probe kontinuierlich zugeführte interne Referenz verwendet, um die Abweichung während der Messung zu korrigieren. Auch der Zeitpunkt der Kalibrierung gehört zum berichteten Ergebnis.
Die Masseninformation liefert auch Hinweise auf den Zustand der Disulfidbrücken. Da beim Aufbau der Brücken Wasserstoff vom Molekül abgespalten wird, ist ein gefaltetes Peptid etwas leichter als seine reduzierte Form; werden beide Zustände derselben Probe gemessen, ist dieser Unterschied erkennbar. Die Rolle der Brücken in der Struktur wurde im Beitrag zu Disulfidbrücken behandelt.
MS/MS: Zugang zur Sequenzinformation
Allein die Masse reicht zur eindeutigen Identifizierung eines Peptids oft nicht aus. Es kann verschiedene Sequenzen mit derselben Masse geben. Deshalb wird die Tandem-Massenspektrometrie, kurz MS/MS, eingesetzt.
Der Ansatz besteht aus drei Schritten. Im ersten Analysator wird das interessierende Ion ausgewählt; anschließend wird es in einer Kollisionszelle durch Stöße mit Molekülen eines inerten Gases kontrolliert fragmentiert; zuletzt werden die m/z-Werte der entstehenden Fragmente gemessen. Die Peptidkette bricht meist an den Bindungen, die die Aminosäuren verbinden, sodass sich die Fragmente jeweils um eine Aminosäure unterscheiden. Der Massenunterschied zweier benachbarter Fragmente ergibt die Identität der dazwischenliegenden Aminosäure; wird die Fragmentreihe von Anfang bis Ende verfolgt, lässt sich ein Teil der Sequenz oder die gesamte Sequenz ablesen.
Das Ablesen ist nicht immer fehlerfrei. Die Massen mancher Aminosäurepaare liegen sehr nah beieinander oder sind gleich; Leucin und Isoleucin lassen sich unter Standardbedingungen nicht unterscheiden. Außerdem bricht nicht jede Bindung der Kette gleich leicht, sodass das Fragmentsignal für manche Bereiche schwach bleiben kann. Diese Lücken werden meist mit anderen Fragmentierungsverfahren oder mit Proben geschlossen, die mit anderen Enzymen vorbereitet wurden.
Zwei grundlegende Ansätze
- Messung des gesamten Moleküls: Das Peptid wird unfragmentiert so gemessen, wie es ist. Für kleine, durch Brücken fixierte Giftpeptide ist das ein schneller Weg zu einem Profil.
- Messung nach enzymatischem Verdau: Das Protein wird zunächst mit einem Enzym, das an bestimmten Bindungen schneidet, in kleine Fragmente zerlegt; danach werden die Fragmente gemessen. Bevorzugt für große Proteine und für den Enzymgehalt.
Die gewonnenen Daten werden mit Datenbanken verglichen, in denen bekannte Sequenzen gesammelt sind. Die Software ordnet die gemessenen Massen und Fragmentmuster den aus den gespeicherten Sequenzen erwarteten Werten zu und erzeugt für jeden Treffer ein Vertrauensmaß. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Treffer zufällig ist, wird mit Verfahren wie einer erneuten Suche mit umgekehrten Sequenzen abgeschätzt.
Grenzen bei neuen Arten
Die Datenbanksuche setzt voraus, dass die gesuchte Sequenz in den Einträgen vorhanden ist. Im Gift einer wenig untersuchten oder neu beschriebenen Art ist die Sequenz vieler Komponenten jedoch noch nicht verzeichnet. In diesem Fall werden zwei Wege verfolgt: Die Sequenz wird direkt aus dem Spektrum abzulesen versucht, oder es wird mit Gensequenzdaten aus der Giftdrüse der Art eine Suchbibliothek aufgebaut. Der zweite Ansatz hat sich in der Giftforschung verbreitet, weil er Transkriptom- und Proteomdaten verbindet.
In solchen Fällen ergibt sich häufig statt eines eindeutigen Namens eine Einordnung in eine Familie: Die Komponente wird danach klassifiziert, wie sehr sie einer bekannten Peptidfamilie ähnelt. Dass das in unserem Referenzchargenbericht beschriebene Peptid mit einem Klassennamen, nämlich α-KTx 3.6, angegeben wird, ist ein Beispiel für diesen Ansatz; die allgemeinen Eigenschaften der Familie wurden im α-KTx-Beitrag beschrieben.
Zusammen mit anderen Verfahren
Die Massenspektrometrie ist kein allein arbeitendes Verfahren. Die Probe wird meist zunächst chromatographisch aufgetrennt; der Trennansatz wurde im HPLC-Beitrag behandelt, das Verfahren, das die Molekulargewichtsverteilung auf einem Gel zeigt, im SDS-PAGE-Beitrag. Diese Verfahren stellen derselben Probe unterschiedliche Fragen; kommen sich gegenseitig bestätigende Ergebnisse zusammen, wird die Identifizierung belastbarer.
Die im Bericht zu unserer Referenzcharge angewandten Verfahren und die erhaltenen Werte werden auf der Analyseseite veröffentlicht. Zu betonen ist, dass die Ergebnisse chargenspezifisch sind und die Messungen für jede Charge neu durchgeführt werden.
