Eine der schnellsten Möglichkeiten zu verstehen, was in einer Lösung enthalten ist, besteht darin, Licht hindurchzuschicken und zu schauen, wie viel davon zurückkommt. Die UV-Vis-Spektrophotometrie macht diese einfache Idee messbar: Licht im ultravioletten und sichtbaren Bereich wird durch die Probe geleitet, und die ein- und austretende Intensität werden verglichen.
Die Grundbausteine des Geräts sind eine Lichtquelle, eine Einrichtung zur Wellenlängenwahl, die Küvette, die die Probe hält, und der Detektor, der das austretende Licht misst. Vor der Messung muss das Lösungsmittel allein gemessen werden, also eine Blindmessung erfolgen; so spiegelt der erhaltene Wert nur den Beitrag des gelösten Stoffes wider.
Auch die Wahl der Küvette beeinflusst das Ergebnis direkt. Gewöhnliche Kunststoff- und Glasküvetten absorbieren im ultravioletten Bereich selbst und verfälschen so die Messung bei 280 Nanometern; in diesem Bereich werden Quarzküvetten verwendet. Saubere Küvettenfenster, keine Luftblasen in der Lösung und ein freier Lichtweg sind Grundvoraussetzungen der Messung.
Wovon hängt die Absorption ab?
Die Absorption ändert sich mit drei Größen gemeinsam: der Neigung des Stoffes, bei dieser Wellenlänge zu absorbieren, der Konzentration in der Lösung und der Weglänge, die das Licht in der Probe zurücklegt. Der lineare Zusammenhang zwischen diesen dreien ist die Grundlage der spektrophotometrischen Messung, und die Weglänge wird bei Standardküvetten konstant gehalten.
Die Linearität hat einen Arbeitsbereich. In sehr konzentrierten Lösungen nimmt das den Detektor erreichende Licht zu stark ab, und die Messung verliert ihre Zuverlässigkeit; in sehr verdünnten Lösungen geht das Signal im Rauschen unter. Deshalb wird die Probe so verdünnt, dass sie in den sicheren Bereich des Geräts fällt, und das Verdünnungsverhältnis wird berücksichtigt.
Auch das Gerät selbst wird vor der Messung vorbereitet. Erwartet werden ein Aufwärmen der Lampe, eine ebene Basislinie und eine regelmäßige Prüfung der Wellenlängengenauigkeit. Driftet die Basislinie, enthält der abgelesene Wert einen Beitrag, der nicht von der Probe, sondern vom Gerät stammt.
Warum 280 Nanometer?
Drei Aminosäuren in Protein- und Peptidketten zeigen im ultravioletten Bereich eine deutliche Absorption: Tryptophan, Tyrosin und, schwächer, Phenylalanin. Der Ringaufbau dieser Reste erzeugt ein Absorptionsmaximum um 280 Nanometer. Der in einer Lösung bei dieser Wellenlänge gemessene Wert ist daher ein praktischer Hinweis auf das Vorhandensein von Protein.
Der zweite Grund für die Wahl ist die Selektivität. Die Peptidbindung selbst absorbiert um 200 Nanometer sehr stark, doch in diesem Bereich absorbieren auch Puffer und Lösungsmittel, sodass die Messung verrauscht ist. 280 Nanometer sind ein Kompromiss, bei dem sich das Proteinsignal ablesen lässt und der Beitrag des Mediums vergleichsweise gering bleibt.
| Wellenlänge | Absorbierende Struktur | Praktischer Hinweis |
|---|---|---|
| ~200 nm | Peptidbindung | Sehr empfindlich, aber hoher Beitrag von Lösungsmittel und Puffer |
| ~260 nm | Nukleinsäuren | Wird als Hinweis auf eine Nukleinsäureverunreinigung der Probe beobachtet |
| ~280 nm | Tryptophan und Tyrosin | Verbreitete Wahl bei der Proteinmessung |
| 320 nm und darüber | Keine nennenswerte Absorption zu erwarten | Ein Anstieg gilt als Hinweis auf Trübung oder Aggregation |
Das gemeinsame Ablesen einer zweiten Wellenlänge stärkt die Deutung. Nukleinsäuren absorbieren um 260 Nanometer stark; das Verhältnis der beiden Werte gibt einen Hinweis darauf, ob die Probe einen von Nukleinsäuren stammenden Beitrag enthält. Bei einem überwiegend aus Peptiden bestehenden Material wie Gift kann dieses Verhältnis als Hilfskriterium für die Sauberkeit der Probenvorbereitung beobachtet werden.
Was sagt die Scankurve aus?
Liest man nicht bei einer einzelnen Wellenlänge, sondern scannt einen breiten Bereich, erhält man das Ergebnis als Kurve. Die Form dieser Kurve sagt mehr als eine einzelne Zahl: Man sieht, wo genau das Maximum liegt, wie glatt der Bereich außerhalb des Maximums ist und ob es zu längeren Wellenlängen hin einen Anstieg gibt. Ein unerwarteter Anstieg bei langen Wellenlängen weist meist auf ungelöste Partikel oder Aggregation hin.
Beim Scan der Referenzcharge unseres Betriebs wurde der Bereich von 190 bis 400 Nanometern gelesen, und das Maximum wurde bei 280 Nanometern aufgezeichnet. Die Messung erfolgte mit einem Shimadzu UV-1900i-Spektrophotometer in einem unabhängigen Labor außerhalb des Betriebs. Das Ergebnis ist damit vereinbar, dass die Probe aus Komponenten mit aromatischen Aminosäuren besteht.
Für die Reproduzierbarkeit der Messung wird auch festgehalten, wie die Probe vorbereitet wurde: Lösungsmittel, Verdünnungsverhältnis, Lösezeit und Messtemperatur. Wird dieselbe Probe in verschiedenen Verdünnungen gemessen, sollten die Werte zum Verdünnungsverhältnis passen; Abweichungen deuten meist auf unvollständiges Lösen oder Aggregation hin, und die Messung wird wiederholt.
Der Scan verbraucht, anders als die meisten Methoden, die Probe nicht. Die Lösung in der Küvette kann nach der Messung zurückgewonnen und für weitere Analysen derselben Probe verwendet werden. Bei einem Material in begrenzter Menge ist das ein praktischer Vorteil, der die Methode an den Anfang der Analysefolge stellt.
Aus demselben Grund wird die spektrophotometrische Messung auch als erster Kontrollschritt bei der Annahme einer Charge verwendet. Liegt das erwartete Maximum nicht an der richtigen Stelle oder weicht die Kurvenform vom Gewohnten ab, wird die Probenvorbereitung überprüft, bevor man zu weiteren Analysen übergeht.
Was sagt das Verfahren nicht aus?
Der Wert bei 280 Nanometern gibt schnell Auskunft über das Vorhandensein von Protein, aber keine Identitätsinformation. Welche Proteine vorhanden sind, in wie viele Komponenten sie sich auftrennen oder welche Molekülmassen sie haben, lässt sich aus dieser Messung nicht ableiten. Außerdem kann ein Peptid mit geringem Gehalt an aromatischen Resten im Verhältnis zu seiner tatsächlichen Menge ein schwächeres Signal als erwartet liefern.
Deshalb wird die Spektrophotometrie nicht für sich allein, sondern als erstes Glied einer Analysekette eingesetzt. Die Zahl der Komponenten wird durch chromatographische Auftrennung bestimmt; Einzelheiten stehen im Beitrag zur HPLC. Für die Molekülmassenverteilung dient die Elektrophorese. Die zahlenmäßige Konzentration erfordert dagegen eine Kalibrierung; der Aufbau der Standardkurve wird im Beitrag zur Proteinbestimmung behandelt.
Die größte Stärke der Methode ist ihre Schnelligkeit: In wenigen Minuten liefert sie, ohne die Probe zu verbrauchen, eine erste Einschätzung. Unsere chargenbezogenen Messergebnisse werden auf der Seite Analyse veröffentlicht; die Werte werden für jede Charge neu gemessen.
