Ein Chromatogramm ist die am Ende einer chromatographischen Untersuchung erhaltene Grafik, die das Detektorsignal über der Zeit darstellt. Auf den ersten Blick ähnelt es einer Reihe von Bergsilhouetten. Richtig gelesen, zeigt es, wie viele Komponenten in der Probe aufgetrennt wurden, in welchem Verhältnis sie zueinander stehen und wie verlässlich die Trennung ist. Das Funktionsprinzip der Methode wurde im HPLC-Beitrag erläutert; dieser Beitrag konzentriert sich darauf, wie die entstehende Grafik interpretiert wird.
Achsen und Grundbegriffe
Die horizontale Achse zeigt die Zeit, in der Regel in Minuten. Die vertikale Achse ist die Antwort des Detektors; bei Ultraviolett-Detektoren wird diese Antwort in Absorptionseinheiten oder in deren Tausendstel, den Milli-Absorptionseinheiten (mAU), angegeben. Der Moment, in dem die Probe auf die Säule gegeben wird, ist der Nullpunkt der Grafik.
Die Zeit, die ein Molekül, das mit der Säule gar nicht wechselwirkt, bis zum Detektor braucht, heißt Totzeit. Die kleine Schwankung am Anfang der Grafik markiert meist diesen Zeitpunkt. Vor der Totzeit kann keine Komponente austreten; die unmittelbar darauf folgenden Peaks stammen von Komponenten, die auf der Säule kaum zurückgehalten wurden und wasserliebend sind.
Viele Programme zeichnen das Gradientenprogramm als zweite Linie über das Chromatogramm. Zu sehen, bei welchem Anteil an organischem Lösungsmittel ein Peak austritt, gibt unmittelbar einen Hinweis auf die Hydrophobie der Komponente. Allerdings erreicht die von der Pumpe eingestellte Zusammensetzung die Säule wegen des Leitungs- und Mischervolumens im System mit einer gewissen Verzögerung; beim Vergleich der Chromatogramme zweier verschiedener Geräte wird diese Verzögerung berücksichtigt.
| Begriff | Wie wird er gelesen? | Was sagt er aus? |
|---|---|---|
| Retentionszeit | Zeit von der Injektion bis zum höchsten Punkt des Peaks | Unter gleichen Bedingungen wiederholbarer Hinweis auf die Identität |
| Retentionsfaktor | Verhältnis der Differenz aus Retentionszeit und Totzeit zur Totzeit | Wie stark die Komponente auf der Säule zurückgehalten wird |
| Peakfläche | Fläche unter der Peakkurve | Signal proportional zur Stoffmenge, die den Detektor erreicht |
| Peakhöhe | Abstand von der Basislinie bis zum Peakmaximum | Schnelle Schätzung; bei breiten Peaks weniger zuverlässig |
| Löslichkeit | Verhältnis des Zeitunterschieds zweier benachbarter Peaks zum Mittelwert ihrer Breiten | Wie weit zwei Komponenten voneinander getrennt sind |
| Symmetrie | Vergleich der vorderen und hinteren Hälfte des Peaks | Tailing oder Fronting |
Peak, Fläche und Höhe
Ein idealer Peak ähnelt einer symmetrischen Glockenkurve. Die Peakfläche steht in Beziehung zur Stoffmenge, die den Detektor passiert hat, und ist die für die quantitative Auswertung maßgebliche Größe. Auch die Höhe enthält ähnliche Information, doch je breiter der Peak wird, desto flacher fällt er bei gleicher Stoffmenge aus; die Höhe gilt deshalb als Abkürzung, die bei schmalen, regelmäßigen Peaks nützlich ist.
Die Berechnung der Fläche heißt Integration und wird von der Software vorgenommen. Die Software entscheidet mit ihren eigenen Parametern, wo die Basislinie beginnt und endet und wo die Peakgrenzen liegen; ändern sich die Parameter, können aus demselben Chromatogramm unterschiedliche Flächenwerte hervorgehen. Zwei verbreitete Entscheidungen, die das Ergebnis verändern, sind das Ziehen einer senkrechten Linie zwischen aneinanderhängenden Peaks und das Abtrennen eines kleinen Peaks mit einer Tangente vom Fuß des großen Peaks. Manuelle Korrekturen im Bericht anzugeben, gehört zur guten Praxis.
Warum ist das Flächenprozent kein Massenprozent?
Das in Berichten häufig anzutreffende Flächenprozent ist das Verhältnis der Fläche jedes Peaks zur Gesamtfläche. Dieser Wert sollte nicht wie das Massenverhältnis der Komponenten gelesen werden, da der Detektor auf jede Komponente unterschiedlich antwortet. Bei einer Messung bei 280 Nanometern liefert ein Peptid, das reich an Tryptophan und Tyrosin ist, ein starkes Signal, ein Peptid mit wenigen dieser Reste erscheint schwach, und ein Peptid ohne sie ist kaum sichtbar. Der Hintergrund der Wellenlängenwahl wurde im Beitrag zu 280 nm erläutert. Für die absolute Menge ist eine Kalibrierung mit dem reinen Standard der betreffenden Komponente erforderlich.
Qualität der Trennung
Fällt das Signal zwischen zwei benachbarten Peaks bis auf die Basislinie ab, sind die Komponenten vollständig getrennt. Erreicht der Auflösungswert etwa 1,5 und mehr, gilt dies in der Regel als erfüllt. Bei niedrigeren Werten überlappen sich die Peaks, und die Flächen beeinflussen sich gegenseitig.
Auch die Symmetrie gibt Auskunft über den Zustand der Trennung. Peaks, deren hintere Flanke sich in die Länge zieht (Tailing), deuten meist auf unerwünschte sekundäre Wechselwirkungen der Komponente mit der Säulenoberfläche oder auf eine Alterung der Säule hin. Peaks, die sich nach vorn ausbreiten (Fronting), werden dagegen mit einer Überladung der Säule oder einer Probenvorbereitung in einem ungeeigneten Lösungsmittel in Verbindung gebracht. Eine Schulter an der Flanke eines Peaks ist häufig die Spur einer zweiten, nicht aufgetrennten Komponente.
Bei Systemen mit Diodenarray-Detektor lassen sich durch den Vergleich der Spektren vom Anfang bis zum Ende eines Peaks zusätzliche Hinweise darauf gewinnen, ob der Peak aus einer einzigen Komponente besteht. Diese Kontrolle ist ein nützlicher Hinweis, kann aber bei der Unterscheidung von Peptiden mit sehr ähnlichen Spektren unzureichend sein.
Schritt für Schritt lesen
- Lesen Sie die Methodenangaben: Säule, Gradientenprogramm, Wellenlänge und Injektionsmenge.
- Prüfen Sie den Blindlauf: Peaks, die im Gradienten ohne Probe auftreten, stammen vom Lösungsmittel oder vom System und werden nicht der Probe zugeordnet.
- Bestimmen Sie die Totzeit und lassen Sie das Signal davor außer Betracht.
- Verfolgen Sie die Basislinie: Eine leichte Drift im Verlauf des Gradienten ist normal, plötzliche Sprünge sind es nicht.
- Zählen Sie die Peaks; Schwankungen, die das Rauschniveau nicht deutlich überschreiten, werden nicht als Peaks gezählt.
- Achten Sie auf die Trennung benachbarter Peaks, auf Symmetrie und Schultern.
- Bewerten Sie die Flächentabelle zusammen mit den Integrationsparametern.
- Legen Sie das Chromatogramm zum Vergleich über ein mit derselben Methode aufgenommenes Referenzchromatogramm.
Für die Rauschschwelle gilt eine verbreitete Regel: Das Niveau, auf dem das Signal das Rauschen um etwa das Dreifache übersteigt, gilt als Nachweisgrenze, das Niveau, auf dem es das Rauschen um das Zehnfache übersteigt, als Grenze für eine verlässliche quantitative Messung.
Lesen im Giftprofil
Bei einer Giftprobe mit Dutzenden von Komponenten wird das Chromatogramm weniger als einzelne Peaks, sondern als Ganzes wie ein Fingerabdruck gelesen. In unserer Referenzchargenanalyse erfolgte die Umkehrphasen-Trennung mit einem Gradienten, dessen Anteil an organischem Lösungsmittel von null auf sechzig Prozent anstieg, und bei 280 Nanometern wurden 37 Proteine und Peptide aufgelöst. Beim Vergleich zweier Chargen werden weniger die Peakzahl als vielmehr die Retentionszeiten der Hauptpeaks und ihre Flächen im Verhältnis zueinander verglichen; kleine Verschiebungen bei einzelnen Peaks bleiben meist innerhalb der Grenzen der Methodenvariabilität.
Ein Chromatogramm trennt Komponenten, benennt sie aber nicht. Welchem Peptid ein Peak entspricht, wird mit ergänzenden Verfahren wie der Massenspektrometrie bestimmt. Unsere Chargenergebnisse und Methodenbedingungen werden auf der Analyseseite veröffentlicht.
