Stabilität bezeichnet, wie lange ein Material, wenn es unter bestimmten Bedingungen gelagert wird, seine Identität, Menge und Beschaffenheit behält. Bei Gift wird die Frage zu: Wie ähnlich fällt das heute gemessene Profil aus, wenn dieselbe Probe nach sechs Monaten oder zwei Jahren erneut gemessen wird? Die Antwort auf diese Frage ist keine einzelne Zahl; sie hängt von Form, Gefäß und den Bedingungen ab, denen die Probe ausgesetzt ist.
Lagerausrüstung und Praxis beim Versand wurden im Beitrag zur Kühlkette, die Vorteile der Trocknung im Beitrag zur Lyophilisation von Gift beschrieben. Dieser Beitrag geht einen Schritt zurück und fragt, was sich auf molekularer Ebene verändert.
Auf welchen Wegen erfolgt die Veränderung?
Veränderungen, die bei Proteinen und Peptiden im Lauf der Zeit auftreten, lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Bei chemischen Veränderungen ändern sich Bindungen im Molekül, es entsteht also ein neues Molekül. Bei physikalischen Veränderungen bleibt das Molekül selbst gleich, doch seine Faltung, seine Löslichkeit oder seine Beziehung zu anderen Molekülen ändert sich.
| Veränderung | Was geschieht? | Beschleunigender Faktor |
|---|---|---|
| Oxidation | Reste wie Methionin, Tryptophan und Cystein reagieren mit Sauerstoff | Licht, Sauerstoff, Spuren von Metallen |
| Deamidierung | Die Seitenketten von Asparagin und Glutamin verlieren die Amidgruppe und werden zu einem andersartig geladenen Rest | Hohe Temperatur, neutraler und basischer pH-Wert |
| Hydrolyse | Die Peptidkette bricht an bestimmten Bindungen | Anwesenheit von Wasser, extreme pH-Werte |
| Enzymatischer Abbau | Die eigenen Enzyme des Gifts zersetzen die übrigen Komponenten | Anwesenheit von Wasser, warmes Milieu |
| Aggregation | Moleküle lagern sich aneinander und bilden größere Strukturen | Temperaturschwankung, Feuchtigkeit, wiederholtes Einfrieren |
| Anhaften an der Oberfläche | Moleküle bleiben an der Gefäßwand haften | Verdünnte Lösung, ungeeignetes Gefäß |
Die Zeile zum enzymatischen Abbau in der Tabelle ist ein giftspezifisches Risiko. Rohgift enthält neben Peptiden auch aktive Enzyme, und solange Wasser vorhanden ist, können diese Enzyme weiterarbeiten. Die Probe nach der Gewinnung rasch zu kühlen und zu trocknen, ist der direkteste Weg, diesen Abbau von innen zu stoppen; das ist auch ein Grund, wässrige Arbeitslösungen nicht lange stehen zu lassen.
Welcher Weg in den Vordergrund tritt, hängt von der Sequenz selbst ab. In der Sequenz des in der Referenzcharge beschriebenen Peptids α-KTx 3.6 mit 36 Resten befinden sich ein Methionin und ein Tryptophan; beides sind oxidationsempfindliche Reste. Die sechs Cysteine derselben Sequenz verbinden sich dagegen miteinander, halten das Molekül straff gefaltet und verleihen ihm eine deutliche Robustheit. Wie eine Sequenz unter diesem Gesichtspunkt zu lesen ist, wird im Beitrag zur Aminosäuresequenz beschrieben.
Temperatur, Licht und Feuchtigkeit
Temperatur
Die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen nimmt mit der Temperatur zu. Als grobe Näherung gilt, dass jede Temperaturerhöhung um zehn Grad viele Abbaureaktionen etwa verdoppelt; dieses Verhältnis schwankt je nach Reaktion, erklärt aber, warum niedrigen Temperaturen so viel Bedeutung beigemessen wird. Wichtig ist nicht nur der Mittelwert der Temperatur, sondern auch ihre Schwankung. In einer Probe, die sich erwärmt und abkühlt, gibt jeder Zyklus den Molekülen eine neue Gelegenheit zur Aggregation. Auch das Einfrieren ist nicht für sich genommen wirkungslos: Wenn Wasser zu Eis wird, konzentrieren sich gelöste Stoffe in der verbleibenden Flüssigkeit, und durch das Ausfallen mancher Puffersalze kann sich der pH-Wert dieser Flüssigkeit verschieben.
Licht
Ultraviolettes und kurzwelliges sichtbares Licht führt zur Energieaufnahme der Reste mit aromatischen Ringen. Die aufgenommene Energie kann in diesen Resten, allen voran Tryptophan und Tyrosin, eine lichtausgelöste Oxidation in Gang setzen. Ein nach Minuten bemessenes Warten auf der Laborbank verursacht für sich genommen möglicherweise kein Problem; Wochen in einem durchsichtigen Gefäß, vor einem Fenster oder auf einem dauerbeleuchteten Regal hinterlassen jedoch eine kumulative Wirkung. Die Gefäßoptionen gegen Licht wurden im Beitrag zur Verpackung verglichen.
Feuchtigkeit
Wasser ist bei den meisten Abbaureaktionen entweder unmittelbar Beteiligter oder das Medium, das die Beweglichkeit erleichtert. In einem trockenen Pulver sind die Moleküle in einem glasartigen Feststoff nahezu unbeweglich; diese Unbeweglichkeit ist die eigentliche Quelle der Stabilität der trockenen Form. Nimmt das Pulver Feuchtigkeit auf, wird dieser Feststoff weich, und die Glasübergangstemperatur sinkt. Im Ergebnis beginnt ein Material, das zuvor selbst bei Raumtemperatur stabil war, sich bei derselben Temperatur schneller zu verändern. Verklumpung und Farbveränderung können die ersten sichtbaren Anzeichen dieses Vorgangs sein.
Wie wird die Stabilität überwacht?
Wie sich ein Material im Lauf der Zeit verändert, erfährt man nicht durch Schätzung, sondern indem dieselbe Probe in bestimmten Abständen erneut gemessen wird. In der Pharmaindustrie ist der Rahmen solcher Studien durch internationale Leitlinien festgelegt; bei Forschungsmaterialien lässt sich dieselbe Logik in einfacherer Form anwenden. Eine typische Studie besteht aus folgenden Schritten:
- Aus derselben Charge werden zahlreiche im selben Gefäß vorbereitete Proben abgetrennt.
- Die Proben werden unter die vorgesehene Lagerbedingung und, zum Vergleich, unter eine belastendere Bedingung gestellt.
- Zu Beginn und zu vorab festgelegten Zeitpunkten wird je eine Probe geöffnet und gemessen.
- Die Ergebnisse werden mit den Ausgangswerten und den Akzeptanzkriterien verglichen.
Eine unter belastender Bedingung durchgeführte beschleunigte Studie gibt rasch einen Eindruck, ersetzt aber nicht das Verhalten unter der tatsächlichen Lagerbedingung; ein Veränderungsweg, der bei hoher Temperatur in den Vordergrund tritt, kann bei niedriger Temperatur überhaupt nicht auftreten.
Auch die Akzeptanzkriterien werden zu Beginn der Studie festgelegt. Welche Veränderung als akzeptabel gilt, hängt vom Verwendungszweck ab: Für eine Anwendung, die nur die Gesamtproteinmenge betrachtet, können kleine Profilverschiebungen unbedeutend bleiben, während dieselbe Verschiebung für eine Studie, die auf ein einzelnes Peptid zielt, ausschlaggebend sein kann.
Auf der Messseite sind die Methoden, die das Giftprofil beschreiben, zugleich Indikatoren der Veränderung. Das Auftreten neuer Peaks im Chromatogramm oder die Abnahme der Flächen der Hauptpeaks kann auf chemische Veränderung, in der Elektrophorese im Bereich hoher Molekülmasse auftretende Banden auf Aggregation, ein Zuwachs des unlöslichen Anteils oder ein sinkender Proteinwert auf physikalischen Verlust hinweisen. Ausgangspunkt ist die Erstanalyse der Charge. Die Erstmesswerte unserer Referenzcharge sind auf der Seite Analyse veröffentlicht; die Lagerbedingung steht in den Produktdokumenten.
Das praktische Ergebnis für das Empfängerlabor lautet: Jedes Öffnen, Auftauen und Warten wird Teil der Geschichte der Probe. Im Nutzungsprotokoll festzuhalten, wie oft das Gefäß geöffnet wurde und wie lange es außerhalb lag, erleichtert die Ursachensuche, wenn später ein unerwartetes Ergebnis auftritt.
